文章导读

年6月3日，医院皮肤性病科暨国家皮肤病与免疫疾病临床研究中心林志淼副教授团队与德国Bonn大学ReginaBetz教授团队，在《TheAmericanJournalofHumanGenetics》杂志(IF:9.)上发表题为“MutationsinSREBF1,EncodingSterolRegulatoryElementBindingTranscriptionFactor1,CauseAutosomal-DominantIFAPSyndrome”的文章，该重要研究成果揭示了固醇通路重要转录因子SREBF1为IFAP综合征的新致病基因。

合作研究团队共收集到11例IFAP病例(含国内5例)，通过全外显子组测序确定了该病的新致病基因SREBF1。其中，迈基诺参与了Family2的全外显子组测序，并分析到SREBF1基因有一个c.CT的错义突变，导致氨基酸改变(p.ArgCys)。

下面请跟随小编的脚步，一起解读我国科学家林志淼副教授的这篇文章吧！

文章背景

IFAP综合征是一种罕见皮肤遗传疾病，其特征为毛周角化、脱发、畏光三联征。在大多数病例中，IFAP综合征表现为X-连锁的遗传模式，主要影响男性，但也有女性携带者出现轻微症状的报告。

主要表现为皮肤病变：

(1)鳞状滤泡性角化病或板层鱼鳞病，伴或不伴银屑病样斑块；

(2)先天性无毛症，虽然稀疏，但在某些情况下存在稀疏的头发。在大多数IFAP患者中，还会出现第三个特征——畏光症；

(3)其他表现包括智力残疾、大脑异常、指甲营养不良、腹股沟疝、无筋膜巨结肠和其他系统异常。

年，作者团队报道了基于X连锁的IFAP综合征患者中发现的MBTPS2基因(MIM:)突变，该基因编码一种膜包埋锌金属蛋白酶，或位点2-蛋白酶(S2P)。在随后的病例报道中也报道了IFAP综合征患者检测到MBTPS2基因突变。MBTPS2基因极有可能是通过影响固醇稳态和表皮/上皮细胞脂质代谢，导致表皮和角膜上皮的分化异常。

迄今为止，尽管大多数受IFAP患者遵循X连锁隐性遗传，但也有一些常染色体显性遗传的IFAP的病例被描述。在一些受IFAP影响的个体中没有检测到MBTPS2基因的突变，这表明了IFAP的遗传异质性。

本文报道了在两个家庭的几个受累成员中和9例常染色体显性遗传的IFAP综合征的散发病例中鉴定出的SREBF1基因的三个不同的杂合胚系突变。SREBF1编码固醇调节元件(SRE)结合转录因子1(SREBP1)。SREBPs是与脂肪基因启动子区域的特定序列SRE结合的转录因子，可以调控脂肪酸和胆固醇的生物合成。SREBF1的编码蛋白固醇调控元件结合蛋白-1(sterolregulatoryelementbindingprotein-1,SREBP-1)是固醇通路上的关键转录因子，可通过感受环境固醇的浓度来调控一系列重要脂质合成基因的表达。

研究思路

样本来源

两个家庭(Fam1andFam2)和9例常染色体显性IFAP综合征的散发病例(个体3–11),Fam1,Fam2,和个体3–5是中国人，由医院皮肤性病科暨国家皮肤病与免疫疾病临床研究中心林志淼副教授团队招募，个体6–11来自六个不同的国家由德国Bonn大学的ReginaBetz教授研究组收集。(见下表)

检测方法

全外显子组测序、转录组测序

研究结果

1.通过全外显子组测序找到IFAP综合征的三个不同杂合突变

为了研究IFAP表型背后的遗传因素，对个体5、10和11及其未受影响的双亲以及Fam1中的III-3个体和Fam2中的III-2个体分别进行了全外显子组测序。对于其中的中国人个体(个体5,Fam1:III-3和Fam2:III-2)，主要分析相同基因的罕见杂合突变(MAF0.),这些突变应存在于所有三个受累个体中，但在个体5的未受影响的父母中不存在。分析结果显示,只有SREBF1基因(GenBank:NM_.3)的突变符合上述标准。经Sanger测序验证，在Fam1:III-3个体中发现了一个3个核苷酸的缺失c._del(p.Asndel；GenBank:NP_.3);在Fam2:III-2个体和个体5中均发现了一个错义突变c.CT(p.ArgCys)。且上述基因突变在家系样本中与表型共分离。此外，通过对自发的杂合突变、有害的纯合突变或复合杂合突变的分析，在个体10中发现了SREBF1基因的另一个杂合子错义突变c.Tc(p.LeuPro)，其父母均未检测到(见图一)。

图1：sanger测序验证三个不同的杂合突变

2.SREBF1突变引起蛋白酶裂解缺陷，导致细胞核转运失败

先前的研究表明，精氨酸和亮氨酸之间的精氨酸-X-X-亮氨酸模体对S1P识别和裂解至关重要(如图2)。为了确定位于该模体内的已鉴定出的突变位点是否影响SREBP1蛋白的裂解，作者用pTK-FLAG-SREBF1(野生型，p.ArgCys,p.Asndel和p.LeuPro)构建体瞬时转染细胞，在HEK细胞中分别表达出了野生型和SREBF1基因GenBank:NM_.3；编码SREBP1a）突变型。构建了变异体p.ArgAla，该变异体在先前的研究中被证明可以消除SREBP1的S1P依赖性裂解，并被用作对照。在固醇充足的情况下，在所有样本的细胞质中均检测到全长的SREBP1蛋白前体，但载体转染的对照组除外(图3A)。在无固醇的条件下，在表达野生型SREBF1的细胞核提取液中检测到一条71kd的、与3xFLAG标记的SREBP1转录活性裂解形式相对应的条带。相反，在表达任何变异型的细胞核样本中，无法检测到这条条带。这些结果表明SREBP1突变体的蛋白水解断裂受到了破坏。

由于蛋白质水解断裂可能影响蛋白质的运输，我们研究了SREBP1突变体的亚细胞定位。通过使用与SREBF1转基因序列融合的3xFLAG标记抗体对转染细胞进行免疫染色，在固醇缺失细胞中，细胞核和细胞质均呈阳性染色。表达野生型SREBP1的细胞核染色最明显。相比之下，表达突变体SREBP1的细胞几乎看不到核染色，荧光信号主要局限于细胞质(图3B)。这些发现表明，SREBP1变异未能移位到细胞核的主要功能部位。

图2：S1P裂解机制

3.SREBP1变异的转录活性降低

作者用荧光素酶报告法评估了突变体的转录活性，用pTK-FLAG-SREBF1共转染HEK细胞(野生型，p.ArgCys,p.Asndel、p.LeuPro或p.ArgAla对照)构建pSRE-GL4.23和pRL-CMV荧光素酶报告系统，然后测定荧光素酶的活性。在固醇条件下，转染任何SREBF1构建物的细胞之间的荧光素酶活性均未观察到显著性差异(图3C)。在甾醇剥夺条件下，转染载体的对照中检测到荧光素酶活性升高，可能是由于HEK细胞中SREBP1的背景表达所致。野生型SREBP1的过表达进一步增加了荧光素酶信号，大约比载体转染的对照组高1.5倍。相比之下，表达p.ArgCys、p.Asndel、p.LeuPro或p.ArgAla突变体的细胞与表达野生型的细胞相比，荧光素酶活性显著降低(分别为33%、41%、28%和47%)。有趣的是，在变异表达细胞中检测到的信号甚至比转染载体的对照细胞中的信号还要低。这可能是由于它们与内源性SREBP1竞争SCAP，后者将SREBP1转运到高尔基体进行蛋白水解裂解。这些结果表明所有SREBP1变异体的转录活性都受到了严重的破坏。

图3:S1P裂解失败导致SREBP-1突变体转录活性降低

4.受影响个体头皮样本中毛囊外毛根鞘相关角蛋白表达下调

林志淼研究组进一步通过对国内4例患者的头皮组织进行转录组测序，研究发现低密度脂蛋白等脂质合成下调，且特异性表达于毛囊外毛根鞘的特定角蛋白也出现了表达下调(见图4)。同时，TUENL染色揭示患者表皮细胞出现大量早期凋亡。这些病生理过程造成了患者毛发脱落及皮肤角化异常。该发现揭示了脂质及胆固醇代谢通路在皮肤、毛发及眼睛正常生理功能中的重要作用，提示调节脂质代谢可能是皮肤角化、脱毛以及角膜疾病治疗的重要靶向通路。

结论

研究组在患者中发现的这三个突变位点均位于SREBP-1蛋白被S1P蛋白裂解的识别位点上。通过对突变体进行体外功能学实验研究，作者发现患者所携带的突变位点使得SREBP1在缺乏固醇的情况下无法被加工成活性形式，进而阻碍了其进入细胞核内发挥转录活性，使得固醇通路相关底物无法被正常转录，抑制了脂质的合成。

本文的研究结果表明，SREBF1突变是导致常染色体显性IFAP综合征发生的重要原因之一。

近年来靶向测序和全外显子组测序得到广泛认可，已成功的应用于发现遗传性疾病的新的致病基因。迈基诺DiaWES基因检测，不仅可以检测点突变、微小插入或缺失，也可以通过算法得到大片段重复、缺失的结果。利用NGS检测缺失重复，重点基因局部增加探针密度，从而分析基因缺失重复时更准确。

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